遗传性脊髓小脑变性的基因研究

遗传性脊髓小脑变性（SCD）包含许多罕见病，这些罕见病具有广泛的临床和遗传异质性，因此其临床诊断和治疗非常复杂。正确诊断是精准治疗的核心，精准治疗作为医学的一个分支，随着人类基因组研究的逐步深入，有望得到蓬勃发展。而新基因的发现有助于精准医学的发展，因为它能诊断出从未诊断的疾病，并能发现更多孟德尔遗传病的病因。本文中，作者探讨了诊断遗传性SCD的临床和遗传方法的演变，以及一些新技术的发展前景。

背景介绍

遗传性痉挛性截瘫（SPG）、小脑共济失调（CA）、痉挛性共济失调和脊髓小脑共济失调（SCA）都属于遗传性脊髓小脑变性 (SCDs)。研究发现他们与200多个基因上的致病性位点相关，涉及的遗传方式有X连锁、常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传和线粒体遗传，偶尔有新生变异。SCDs的临床特征是小脑共济失调和肢体痉挛，合并其他神经系统或神经系统以外的特征。SCDs的遗传和表型异质性使其诊断变得复杂。加上SCD的临床表现与其他神经系统疾病的临床表现相重叠，导致其诊断更加复杂。因此，我们需要借助一些不断更新的工具和方法去对这类疾病进行诊断。

据估计，脊髓小脑退化症在世界范围内的发病率为1：10000，属于罕见病的范畴。70%以上的罕见病具有遗传性，其中大部分影响到神经系统。从生物学的角度来看，孟德尔遗传病可以看作是基因、通路的抑制或增强，这有助于深入了解复杂的生物系统及一些常见的复杂的疾病。从流行病学和临床的角度来看，孟德尔遗传病影响世界上2.5%以上的人群，所以其临床诊断对于这些遗传病的患者及其家庭来说非常有价值。孟德尔遗传病病因的发现，在某些情况下会产生滚雪球效应，能使我们发现更多的疾病。

SCD基因的鉴定过程有几个里程碑，在这个过程中也用到了很多的工具（图1）。SCD疾病数量的演变主要得益于以下几个方面的改进：诊断的工具、成本、临床表型和样本量。在本文中，作者回顾了用于识别新型SCD基因的方法随着时间的推移所发生的变化，并讨论了将这些方法与新型工具相结合的可能性，从而提高目前SCD的诊断率，并指出了目前在这些疾病中遇到的一些挑战。

全基因组连锁分析和同质性图谱

对于近亲结婚来说，全基因组连锁分析和同质性图谱分析是用于识别与孟德尔遗传病相关的基因和位点的主要方法。这些方法在20世纪80年代得以发展，主要是由于对遗传标记的检测和染色体图谱的分配。连锁分析的概念依赖于遗传变体与疾病基因座上的标记位点共分离，因为重组不太可能分离相邻的位点。微卫星标记和基于阵列的单核苷酸多态性（SNP）标记在SCD基因研究中得到了广泛应用。这些方法取代了20世纪80年代使用的限制性片段长度多态性（RFLP）和串联重复数（VNTR）。目前SNP标记通常用于DNA 微阵列或外显子/基因组测序数据。

大多数SCD研究都是通过将连锁分析与其他方法相结合从而确定致病基因，如基因筛选或二代测序。比如有研究用连锁分析和突变筛选确定了导致常染色体隐性脊髓小脑共济失调（SCAR）13型的突变。目前仍有22个SCD基因位点尚未找到致病基因。如果致病变体位于非编码区，则可能被遗漏。通过连锁分析确定染色体位置对鉴定几个核苷酸重复扩增的疾病至关重要，如伴神经病变和前庭反射消失的小脑性共济失调综合征(CANVAS)，就是由于RFC1的内含子重复扩增导致。微卫星或SNP标记的使用并不局限于识别疾病位点，而是可以扩展到建立致病变体的创始人效应。

重复扩增检测

简单DNA序列重复扩增可导致40多种疾病，而且多数表型和中枢神经系统有关。20世纪90年代，在一系列SCA基因座中首次发现了这些基因。有学者通过直接对具有常染色体显性遗传模式的病人进行重复扩增的筛选，从而确定了导致齿颊部-苍耳部萎缩、SCA7和SCA8的基因。同时还确定了Friedreich共济失调的病因，Friedreich共济失调是一种最常见的常染色体隐性共济失调，通常由FXN基因的内含子重复扩增引起。

近年来，随着基于PCR的方法和短读序列分析算法的改进，人们对重复扩增的兴趣又有所提高。通过连锁分析和短读全基因组测序（WGS）确定了DAB1和RFC1的重复扩增能分别引起SCA37和CANVAS。而长读测序方法可进一步提高重复扩增的检测。目前采用检测DNA重复扩增的方法发现了5%的SCD亚型，其中大部分是与全基因组连锁分析联合使用发现的。

候选基因分析

在所有识别SCD基因的方法中，确定基因的优先次序非常关键，这一步通常取决于基因的表达、基因的功能或其产物的功能，以及患者和动物模型的表型。候选基因分析是鉴定9.1%的SCD亚型的主要方法。有多种神经变性的小鼠模型，尤其是有小脑特征的小鼠模型，在指导候选基因筛选方面有很大的参考价值。有学者在有神经系统表型的患者中筛选CACNB4基因的突变，因为他们在一个出现共济失调和癫痫的小鼠模型中筛选出了CACNB4基因的双等位基因突变，并且确定CACNB4是导致5型发作性共济失调（EA5）的原因。NHE1基因可以编码钠氢交换器1，其功能性变体的缺失与 Lichtenstein-Knorr综合征有关。Lichtenstein-Knorr综合征是一种小脑综合征，伴有感音神经性听力障碍，而NHE1和CHP1基因敲除的小鼠也会有部分Lichtenstein-Knorr综合征的表型。人类遗传学有时也可以促进动物遗传学的发展。有学者通过全基因组数据的优化，在有痉挛性抽搐表现的夏洛莱牛中发现了KIFC变体，而该基因也与人的一个相似的疾病有关。

患者的临床和生物学特征也有助于找到特定的候选基因。比如患者的临床表现联合辅酶Q10检测有助于找到SCAR 9型中ADCK3的致病性突变。患者的表型和预示甲状腺激素抵抗的激素分析有助于发现X连锁SPG22中的SLC16A2突变。同样，结合临床表型也有助于发现一些由线粒体改变引起的SCD亚型。

有学者采用酵母双杂交筛选和硅点网络方法鉴别SCD基因的相互作用。他们通过HSP硅基功能网络确定了HSP家族的三个致病基因。基于这个 "HSP网络"，筛选了三个候选基因，通过直接测序将REEP2、MAG和BICD2基因确定为新的HSP基因。沿着这条思路，有人用其他方法找到了SPG48基因；他们首先在HeLa细胞中进行RNAi全基因组筛选找到了AP5Z1基因。AP5Z1能与spastascin和spastizin相互作用，这两个蛋白分别涉及SPG11 和SPG15基因。随后对166名不明原因的HSP患者的AP5Z1基因进行了测序，并确定了第一个SPG48病例。以上这些研究说明了解SCD蛋白的相互作用非常有用，因为它们可能是患者潜在变异的来源。

另外，细胞水平上的生理病理学知识也能指导候选基因的分析。有学者筛选了一组不明原因的发作性共济失调和偏瘫性偏头痛患者，发现了SLC1A3基因突变，SLC1A3基因编码的谷氨酸转运体对于从突触裂隙中清除谷氨酸至关重要。而谷氨酸是神经系统中最丰富的氨基酸神经递质。通过这项研究发现了一个SLC1A3的杂合突变引起的偶发性共济失调，也叫后期发作性共济失调（EA）6型（EA6）。

DNA微阵列

DNA微阵列在临床上主要用于研究拷贝数变异（CNVs），也有助于确定SNP 基因型。诊断神经发育障碍的首选方法是DNA微阵列，其相关疾病有智力障碍、发育迟缓症、自闭症谱系障碍和有多种先天性异常的疾病。但是最新的一项荟萃分析发现，在诊断神经系统疾病方面WES优于芯片。采用阵列结合其他分析方法已经找到了目前所有已知20%的SCD基因，其中一半以上采用的是微阵列和WES的方法。

二代测序技术

NGS的出现彻底改变了医学遗传学的领域，因为能在很短时间内对大量目标进行平行测序，而且成本急剧下降。NGS主要是根据目标序列进行分类。WGS目标序列是整个基因组，WES目标序列是基因组中的编码区，而在靶向NGS（TS）中，它是一组定制的基因和序列。根据测序片段的长度，NGS也分为长读测序和短读测序。短读测序中的序列长度是75-300个碱基对，而理论上来说，长读测序的长度相当于模板序列的长度。

二代测序在诊断孟德尔遗传病诊断中应用广泛，包括那些具有神经系统表型的疾病。到目前为止，用NGS方法已经识别了47.3%的SCD基因。从2009年二代测序技术出现后，SCD基因的斜率发生了巨大变化（图2）。

靶向NGS 

靶向NGS是临床上最常用的NGS工具，采用靶向NGS确定了7.3%的已知SCD亚型。以TS为主要研究方法进行了四项研究，发现了四个新的SCD亚型。第一项研究是对一个X连锁小脑共济失调家族的X染色体上的所有外显子进行测序，发现了ATP2B3基因的错义突变。ATP2B3的致病性突变导致了X连锁的SCA1型。其他三项研究中，TS分析SPTBN2、KIF1A和TUBB4A的致病性突变可分别导致SCA5、常染色体隐性SPG30，以及常染色体显性的4型肌张力障碍和6型低髓鞘白营养症。因此，将SCD添加到与先前已知的导致SCD以外疾病的基因相关的临床表型中。比起SCD真正的基因鉴定，这种情况在最近几年变得更加频繁，如图2中的曲线斜率变化。

全外显子组测序（WES）

全外显子组测序覆盖了约1-2%的人类基因组，在孟德尔遗传病诊断中应用广泛。不同的公司也将3'和5'的非翻译区（UTRs）添加在大多数WES检测项目中，但这些区域的变异比较难分析和解释。目前已知约20%的蛋白质编码基因的突变与疾病性状有关。

那么诊断SCDs患者的首选方法到底是TS还是WES？TS的成本更低，测序深度更深，分析时间较短。WES覆盖率更高，在发现孟德尔遗传病致病基因方面表现更好。单独用WES进行基因筛查，发现了20.5%的已知SCD亚型。把WES与其他技术相结合，还能检测到另外的21.4%。重点外显子组测序（FES）是一种基于WES的方法，具有TS和WES的一些优点。FES的覆盖率比TS高，因为FES的目标是5000个疾病相关基因，占WES目标序列的20%。与WES相比，FES的测序深度更深，但发现新SCD基因的潜力较小。

与散发性病例相比，WES在家族性病例中的诊断率更高，当然也有例外。研究发现散发性小脑共济失调患者的诊断成功率为73%。对未诊断的外显子进行重新分析，并将WES与其他遗传学方法，如mRNA测序和CNV检测相结合，也能提高WES的诊断率。在一些SCD亚型中CNVs比较常见，如SPG4和SCA15。它们可以通过测序数据找到，但根据所使用的算法和文库制备的不同，其比率也不同，因此比较倾向于用微阵列比较基因组杂交技术（CGH）或多重连接探针扩增（MLPA）来检测CNV。有研究报道，对一组SCD患者的WES数据进行重分析，其诊断成功率上升了7%。另外，最近的报道也主张对WES数据定期进行重分析。

全基因组测序（WGS）

全基因组测序是研究基因组的最全面的工具，WGS的一个显著优势就是能够检测构成人类基因组的大部分的基因间和内含子区域。这种能力是一把双刃剑，与外显子变体相比，基因间和内含子变异的解释比较困难。与WES相比，WGS的覆盖率较低但更均匀，这种外显子序列覆盖的均匀性使其能更好地检测富含GC的区域。

目前为止，WGS已经参与发现了三个SCD基因。Melo等人在SPG、视神经萎缩和神经病变（SPOAN）患者的KLC2基因上游的非编码序列中发现了一个同源的216bp缺失。在筛选的275名SPOAN患者时发现了这个216bp的缺失，并在斑马鱼模型中验证了其致病性。在一个早发HSP并发周围神经病变的家庭中，使用WGS发现了RNF170基因的双拷贝变异。随后在GENESIS平台上发现更多具有致病性RNF170变异的患者，通过对其共享测序数据的分析证实了他们的发现。

全基因组方法目前在确定新的SCD亚型方面是最成功的，已经确定了86.4%的(190/220)的已知SCD亚型。这些方法包括连锁分析、WES、WGS和DNA微阵列。过去发现SCD基因的过程中，往往要事先了解这些基因的功能和表达谱。现在，WES正在主导SCD基因的发现，而且WGS也将主导孟德尔遗传病基因的发现。

总而言之，诊断孟德尔遗传病的工具箱正在不断扩大，包括多种 "开箱即用 "的方法。这些宝贵的工具和方法（图3）已经解决并将继续解决一些孟德尔遗传病诊断的难题。

来源：北京康旭医学公众号